Détection d'acide nucléique viral

Les séquences génomiques de la plupart des virus sont connues.Sondes d'acide nucléique qui sont de courts segments d'ADN conçus pour s'hybrider avec des segments complémentaires d'ADN ou d'ARN viral.La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique plus efficace pour la détection virale.Des méthodes de diagnostic à haut débit ont été développées récemment.

A. Technique d'hybridation d'acide nucléique

L'hybridation d'acide nucléique, comprenant principalement le Southern blot (Southern) et le Northern blot (Northern), est une nouvelle technique qui se développe rapidement dans le domaine du diagnostic des virus.La raison d'être du test d'hybridation est d'utiliser de courts segments d'ADN (appelés "sonde") conçus pour s'hybrider avec des segments d'ADN ou d'ARN viraux complémentaires.Par chauffage ou traitement alcalin, l'ADN ou l'ARN cible double brin est séparé en simple brin puis immobilisé sur un support solide.Après cela, la sonde est ajoutée et hybridée avec l'ADN ou l'ARN cible.Comme la sonde est marquée avec un isotope ou un nucléide non radioactif, l'ADN ou l'ARN cible peut être détecté par autoradiographie ou par le système biotine-avidine .Étant donné que la plupart des génomes viraux ont été clonés et séquencés, ils peuvent être détectés à l'aide de séquences spécifiques au virus comme sondes dans l'échantillon.Actuellement, les méthodes d'hybridation comprennent : le dot blot, l'hybridation in situ dans des cellules, le transfert d'ADN (ADN) (Southern blot) et le transfert d'ARN (ARN) (Northern blot).

Technologie B.PCR

Ces dernières années, une série de techniques d'amplification d'acides nucléiques in vitro a été développée sur la base de la PCR, pour tester des virus insensibles ou incultivables.La PCR est une méthode qui peut synthétiser une séquence d'ADN spécifique par réaction de polymérase in vitro.Le processus de PCR comprend un cycle thermique en trois étapes : dénaturation, recuit et extension. À haute température (93℃~95℃), l'ADN double brin est séparé en deux brins d'ADN simples ;puis à basse température (37℃~60℃), deux amorces nucléotidiques synthétisées s'hybrident aux segments d'ADN complémentaires ;tandis qu'à la température appropriée pour l'enzyme Taq (72 ℃), la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN commence à partir de l'extrémité 3' de l'amorce en utilisant de l'ADN complémentaire comme matrice et des nucléotides simples comme matériaux.Ainsi, après chaque cycle, une chaîne d'ADN peut être amplifiée en deux chaînes.En répétant ce processus, chaque chaîne d'ADN synthétisée dans un cycle peut être utilisée comme matrice dans le cycle suivant, et le nombre de chaînes d'ADN est doublé à chaque cycle, ce qui signifie que la production de PCR est amplifiée à une vitesse de 2n log.Après 25 à 30 cycles, la production de PCR est identifiée par électrophorèse et les produits d'ADN spécifiques peuvent être observés sous lumière UV (254 nm).Pour son avantage de spécificité, de sensibilité et de commodité, la PCR a été adoptée dans le diagnostic clinique de nombreuses infections virales telles que le VHC, le VIH, le CMV et le VPH.Comme la PCR est très sensible, elle peut détecter l'ADN du virus au niveau fg, l'opération doit être effectuée très soigneusement pour éviter les faux positifs.De plus, un résultat positif au test d'acide nucléique ne signifie pas qu'il y a un virus infectieux vivant dans l'échantillon.

Avec une large application de la technique PCR, de nouvelles techniques et méthodes sont développées sur la base de la technique PCR pour différents objectifs de test.Par exemple, la PCR quantitative en temps réel peut détecter la charge virale ;La PCR in situ est utilisée pour identifier l'infection virale dans les tissus ou les cellules ;La PCR nichée peut augmenter la spécificité de la PCR.Parmi eux, la PCR quantitative en temps réel s'est développée plus rapidement.De nombreuses nouvelles techniques, telles que la sonde d'hydrolyse TaqMan, la sonde d'hybridation et la sonde de balise moléculaire, ont été combinées en une technique de PCR quantitative en temps réel, qui est largement utilisée dans la recherche clinique.Outre l'identification précise de la charge virale dans le liquide corporel des patients, cette méthode peut également être utilisée pour détecter un mutant tolérant aux médicaments.Par conséquent, la PCR quantitative en temps réel est principalement appliquée dans l'évaluation des effets curatifs et la surveillance de la tolérance aux médicaments.

C. Détection à haut débit d'acides nucléiques viraux

Pour répondre aux besoins de diagnostic rapide des nouvelles maladies infectieuses émergentes, différentes méthodes de détection à haut débit, comme les puces à ADN (ADN), ont été mises en place.Pour les puces à ADN, des sondes spécifiques sont synthétisées et attachées à de petites puces en silicium à très haute densité pour former un microréseau de sondes à ADN (ADN) qui peut être hybridé avec un échantillon.Le signal d'hybridation peut être imagé par un microscope confocal ou un scanner laser et être ensuite traité par l'ordinateur et un énorme ensemble de données concernant différents gènes peut être obtenu.Il existe deux types de puces à ADN.La "puce de synthèse" est la suivante : les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur les puces.Un autre est la puce de pool d'ADN.Les gènes clonés ou les produits de PCR sont imprimés de manière ordonnée sur la lame.L'avantage de la technologie des puces à ADN est la détection simultanée d'une grande quantité de séquences d'ADN.La dernière version de la puce de détection d'agents pathogènes peut identifier plus de 1700 virus humains à la fois.La technologie des puces à ADN a résolu les problèmes des méthodes traditionnelles d'hybridation d'acides nucléiques et a de très larges applications dans le diagnostic viral et l'étude épidémiologique.